- Introductie
De omzet (aanmaak en afbraak) van cellulaire eiwitten werd in 1930 ontdekt in studies van Rudolf Schoenheimer, maar het was pas in de jaren 60 dat het niet om normale omzetting ging, maar een hoogst selectief proces. Tegen het einde van de jaren 70 werkten twee onafhankelijke groepen aan twee verschillende onderwerpen: in het laboratorium van Avram Hershko in Haifa, Israel, werkten Hersko en Ciechanover aan de ATP afhankelijke afbraak van de tyrosine amminotransferrase. Zij isoleerden een eiwit en noemden het: ATP afhankelijke Proteolytische Factor 1 (APF-1). Aan de andere kant van de Atlantische oceaan settelde Alexander Varshavsky zich in Boston, waar hij geinteresseerd raakte in een DNA gebonden eiwit dat 1 C-terminus en opmerkelijk genoeg 2 N-termini had! Het DNA gebonden eiwit was histon 2A en het andere eiwit werd geidentificeerd als zijnde ubiquitine, een 76-aminozuur groot eiwit met onbekende funktie dat als vrij eiwit beschreven werd door Gideon Goldstein en zijn collega's in 1975. In 1980 lieten Keith Wilkinson, Michael Urban en Arthur Haas zien dat APF-1 en ubiquitine een en hetzelfde eiwit zijn.
- Ubiquitine-Proteasoom Systeem (UPS)
Conjugatie van ubiquitine aan substraat eiwitten is een van de bekendste post-translationele modificaties in de cel. Het kan substraat eiwitten niet alleen markeren voor afbraak, maar is ook betrokken bij gen transcriptie, endocytose en DNA schade herstel. De bekendste functie is natuurlijk wel die bij eiwit afbraak. De conjugatie van 4 of meer ubiquitines aan een doel eiwit zal het eiwit markeren voor afbraak door het proteasoom. (zie figuur). Dit mega-Dalton complex is verantwoordelijk voor de ontvouwing en afbraak van eiwitten tot aminozuren.
Ubiquitinering is een gevolg van een cascade van ubiquitine overdracht tussen verschillende eiwitten: ubiquitine wordt eerst geactiveerd in een ATP afhankelijke manier door een ubiquitine-activerings enzym, genaamd E1 (zie figuur). Geactiveerd ubiquitine wordt dan overgedragen aan een ubiquitine-conjugatie enzym, genaamd E2. Dit geactiveerde E2 eiwit werkt dan samen met een ubiquitine-ligase, genaamd E3, om de ubiquitine over te zetten naar het substraat, waar de ubiquitine via een iso-petide binding (covalent) tussen de ε-amino groep van het lysine residue van het substraat en de c-terminale glycine van ubiquitine. Om het gedrag van ubiquitine in levende cellen te bestuderen, hebben we het Groen Fluorescente Eiwit (GFP) aan de N-terminus van ubiquitine gefuseerd, zoals reeds werd beschreven door Yewdell en Dantuma. Met dit systeem zijn wij in staat ubiquitine en het proteasoom te vergelijken in stabiel getransfecteerde cellen, want we beschikten al over een β1i-GFP (LMP2-GFP) cellijn met een gefuseerde proteasoom sunbunit.
- Benadering
Zoals hierboven vermeld hebben wij GFP aan de N-terminus van ubiquitine gefuseerd en stabiele cellijnen gegenereerd die dit fusie eiwit tot expressie brengen. We hebben meerdere technieken gebruikt om er zeker van te zijn dat het eiwit doet wat het moet doen (covalent binden aan substraat eiwitten) en niet doet wat het niet moet doen (verandering van MHC klasse I expressie op de plasmamembraan of van de cel cyclus). Wij hebben geprobeerd meer inzicht te krijgen in de localisatie van ubiquitine en de mobiliteit met behulp van de fluorescentie technieken Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP, herstel van fluorescentie na deactivatie m.b.v. licht) en Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP, het verlies van fluorescentie door deactivatie m.b.v. licht). Voor zeer snelle FRAP metingen hebben wij gebruik gemaakt van een confocale microsckoop, die uitgerust is met een externe bleach laser voor de deactivatie van GFP om te voorkomen dat de microskoop iedere keer spiegels, laser intensiteiten etc. moet misselen. Diffusie en localizatie van het proteasoom wordt niet beinvloed door proteasoom inhibitie en FLIP experimenten laten zien dat er geen uitwisseling mogelijk is tussen de kern en het cytoplasma (zie voorbeeld).- Referentie
- J.Neefjes, T. Groothuis, and N. Dantuma. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde 2004 vol.148 pp.2579-82. |
Download PDF
Problemen in het ubiquitine-proteasoom systeem worden in verband gebracht met verschillende ziektes, vooral ziektes die gerelateerd zijn aan aggregatie, zoals de ziektes van Huntington, Alzheimer en Parkinson. Verlengde herhalingen van CAG sequenties in de betrokken eiwitten zorgen ervoor dat de eiwitten aggregeren in het cytoplasma en de kern, zodat ze niet meer af kunnen worden gebroken door het proteasoom, alhoewel zowel ubiquitine en proteasoom in de aggregaten aanwezig zijn. Aggregaten worden gevormd door de cel om beter te kunnen omgaan met de niet goed gevouwen eiwitten.
Therapieen gericht op het proteasoom kunnen helpen in de bestrijding van kanker. Op dit moment zijn er klinische tests gaande die de toepasbaarheid van inhibitie van het proteasoom moeten onderzoeken. De tests worden gedaan op verschillende soorten kanker, waaronder vaste tumoren, en hematologische kankers. Millennium heeft VELCADE™ (bortezomib) onwikkeld voor injectie en zal de eerste proteasoom remmer zijn die wordt bestudeerd in klinische tests op mensen. Het gebruik van deze drug om multiple myeloom te bahandelen heeft een versnelde goedkeurings status van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) gekregen.