- Introductie
Virale en bacteriële infecties vormen een serieuze en constante bedreiging voor ons welzijn. Gelukkig voor ons heeft ons lichaam adequate tegenmaatregelen ontwikkeld in de vorm van ons afweersysteem, die de strijd aangaat met deze opportunistische en vreemde indringers. Materiaal van zowel intra- en extracellulaire afkomst wordt continu gepresenteerd aan de cellen van ons immuunsysteem en op deze manier gecontroleerd op verdachte activeiten. De presentatie van antigenen wordt gedaan via drie verschillende routes (zie zijkant), waarvan er één de zogenaamde MHC klasse II route is. Als een cel eenmaal wordt herkend als geïnfecteerd wordt deze geëlimineerd door witte bloedcellen die op deze manier verdere verspreiding van de infectie voorkomen.
- MHC klasse II route
De MHC klasse II route knipt materiaal dat is omgenomen door de cel vanuit zijn omgeving in kleine peptide (ook wel antigenen genoemd), die vervolgens worden geladen op de zogenaamde MHC klasse II moleculen waarnaar deze route is genoemd. Eenmaal beladen gaan de klasse II moleculen naar het cel oppervlakte waar ze de gebonden antigenen presenteren aan de CD4+ T-cellen van het immuunsysteem (zie figuur). Deze complexe cascade van reacties wordt ondersteund door een aantal gespecialiseerde chaperone moleculen, te beginnnen met de Invariante keten in het endoplasmatisch reticulum. Deze chaperone bindt de klasse II moleculen direct na synthese en houdt tijdelijk de peptide bindings pocket bezet. Tegelijkertijd dirigeert het het gevormde complex naar het cellulaire compatiment waar antigeen belading dient plaats te vinden, de MHC klasse II bevattende compartimenten (MIIC). In deze lysosomale compatimenten wordt de invariante keten afgebroken door proteases totdat alleen het gedeelte dat de peptide bindings pocket bezet houdt overblijft, genaamd CLIP. Een tweede gespecialiceerde chaperone, HLA-DM, helpt bij het uitwisselen van dit CLIP fragment voor een antigeen peptide, waarna de klasse II moleculen naar de oppervlakte worden gebracht. HLA-DM speelt een cruciale rol in deze route, zonder haar aanwezigheid is het proces van antigeen presentatie via MHC klasse II moleculen namelijk sterk verminderd. Daarom hebben wij een meetmethode ontwikkeld die de interactie tussen HLA-DM en klasse II moleculen direct kan visualiseren in levende cellen.
- Benadering
We hebben stabiele cellijnen gemaakt die het klasse II molecuul HLA-DR gekoppeld aan de cyano variant van GFP, en HLA-DM gekoppeld aan de gele variant (YFP) expresseren. Het labelen van deze moleculen met GFP heeft invloed op hun functioneren en localisatie. Met behulp van Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie kunnen we nu direct bepalen of beide moleculen interacteren en waar dit plaats vindt (zie figuur). Als controle maakten we een additionele cellijn die HLA-DO/CFP en HLA-DM/YFP expreseerden. HLA-DO is opnieuw een gespecialiseerde chaperone die tot expressie in B-cellen, en waarvan bekend is dat het continu interacteert met HLA-DM. Met behulp van de FRET methode hebben wij de interactie tussen HLA-DR en HLA-DM bestudeerd onder verscheidene condities waarvan beschreven is dat ze MHC klasse II antigeen presentatie beinvloeden.- Resultaten
- Interactie tussen HLA-DR en HLA-DM werd geobserveerd in MIICs. Om te testen of deze interactie een zure pH nodig heeft in de MIIC hebben wij de stof Chloroquine toegevoegd die in twee minuten de pH in deze compartimenten neutraliseert. Ondanks dat pH gevoeligheid is beschreven in vitro was dit niet het geval in levende cellen, wat er op duidt dat additionele factoren deze interactie in stand houden in vivo. De MIIC hebben een speciale architectuur en bestaan uit een limiterende membraan die meerdere kleine interne vesicles omvat. Om te testen of deze speciale structuur essentiëel is voor een juiste interactie tussen HLA-DR en HLA-DM hebben we de MIIC laten zwellen, de natieve MIICs zijn immers te klein om een verschil te kunnen zien tussen interne en buiten membraan met behulp van confocale microscopie. Langdurige behandeling met chloroquine staat bekend om het induceren van gezwollen MIICs, en na 6 uur behandeling liet electronen microscopie zien dat deze gezwollen vesicles leeg zijn van interne structuren. Verrassend was dat de HLA-DM/HLA-DR interactie niet langer werd waargenomen in deze gezwollen MIICs (zie figuur). Omdat het zwellen van de MIIC geleidelijk gaat, herhaalden we het experiment maar nu met maar 3 uur chloroquine behandeling, en zagen partieel opgezwollen vesiscles met nog steeds een paar interne structuren. FRET werd alleen gemeten FRET op de interne structuren maar niet op de buiten membraan (zie figuur). De interne structuren van de MIIC vormen dus een speciaal "MHC klasse II ladings microdomein" die de interactie tussen HLA-DR en HLA-DM faciliteert.
Deze resultaten werden bevestigd met behulp van een alternatieve manier om de MIIC te laten zwellen. Door het uitschakelen van VPS34, een lipide kinase, voorkwamen we de formatie van interne structuren. Opnieuw werd er geen interactie tussen HLA-DR en HLA-DM gedecteerd op de buiten membraan van de gezwollen MIICs. Interessant in deze is dat veel bacterië intracellulair overleven in zogenamede phagosomen, die ook alleen een buiten membraan bevatten. Daarbij, het is beken dat deze bacteriën effector eiwitten uitscheiden die het lipide metabolisme moduleren, bijvoorbeeld door VPS34 te beinvloeden. Daarom infecteerden we onze cellen met Salmonella (zie figuur). Opnieuw werd er geen interactie tussen HLA-DR en HLA-DM geobserveerd op de omliggende membraan rondom de bacterie, terwijl deze interactie wel gewoon plaats vond op normale MIIC in dezelfde cel (zie figuur). Biochemische analyse bevestigde dat er ook inderdaad geen peptide belading plaats vond in deze phagosomen. De afwezigheid van HLA-DR en HLA-DM interacties op de buiten membraan voorkomt dus lokale belading van MHC klasse II moleculen in phagosome, waardoor deze bacteriën succesvol het immuunsysteem kunnen omzeilen (zie figuur).- Vooruitzichten
- De focus van ons huidige onderzoek richt zich op het identificeren van de factoren die het MHC klasse II micro-loading domain vormen in de interne vesicles van de multi-vesiculaire bodies.
- Referentie
- W.Zwart and A. Griekspoor, et al. Immunity 2005 vol.22 pp.221-233. |
Download PDF | Supplementaire Data | Persbericht
Ons afweer systeem heeft drie routes ontwikkeld om vreemde zaken tegen te gaan die ons lichaam proberen binnen te dringen. De MHC klasse I route is functioneel in alle cellen met een kern, en controleert continu de intracellulaire eiwit inhoud op potentiëel gevaar van binnen uit, zoals virus infecties en tumorigene signalen. Daarentegen controleert de MHC klasse II route materiaal dat is opgenomen door de cel vanuit de buitenwereld, op zoek naar bacteriën en parasieten die extracellulair leven. Deze route is alleen aanwezig in cellen van het afweersysteem. Tot slot presenteert de CD1 route lipiden van zowel intra- als extracellulaire afkomst, een route die zich lijkt te hebben ontwikkeld om specifieke intracellulaire bacteriën tegen te gaan.
De meeste bacteriën leven buiten de cel in ons lichaam waar ze relatief makkelijk zijn te ontdekken door het afweersysteem. Een aantal bacteriën heeft daarom besloten om zich te verstoppen en hebben zich zo ontwikkeld dat ze intracellulair leven. Pathogenen zoals Salmonella typhimurium - de veroorzaken van Salmonella voedselvergiftiging -, Mycobacterium tuberculosis, en Mycobacterium leprae gaan de cel binnen, overleven daar en planten zich voort in speciale organellen, phagosomen genaamd, uit het zicht van het afweersysteem. Om dit proces mogelijk te maken secreteren deze bacteriën speciale factoren, effector eiwitten genaamd, die de normale cel machinerie zo moduleren dat het de bacterie helpt binnen te komen en te overleven.
