- Introductie
Veel cellulaire processen kunnen op elegante wijze worden bestudeerd met biochemie. Normaal gesproken betreft dit experimenten waar een groot aantal cellen worden gelyseerd, waarna de eiwit inhoud vervolgens wordt geisoleerd en bestudeerd met anti-lichamen op verschillen in eiwit niveaus, post-translationele modificaties, etc. Ook al zijn deze proeven veelal uiterst informatief, ontbreekt in deze massale analyse vaak de tijdsresolutie om snelle veranderingen te meten in eiwit status, en dus zeer dynamische processen te karakteriseren. Sterker nog, de analyse van miljoenen cellen tegelijk toont uiteraard de gemiddelde respons van een populatie van cellen, en verhult daardoor de cel tot cel variatie en het dynamisch berei van een proces. Tot slot is het niet mogelijk om subcellulaire compartimentalisatie van reacties te bestuderen.
Met de beschikbaarheid van microscopische technieken in combinatie met genetisch gecodeerde fluorescente eiwitten, kunnen veel van deze tekortkomingen overwonnen worden. Zeer dynamische reacties kunnen nu in detail bestudeerd worden in een relatief eenvoudige manier, en in de context van een levende cel.
- Fluorescence Resonance Energy Transfer
Eën van deze technieken is Fluorescence Resonance Energy Transfer, afgekort FRET, een fysisch fenomeen dat al jaren geleden is beschreven. FRET is de golfloze overdracht van energie van een geëxiteerd donor fluorofoor naar een geschikte acceptor fluorofoor, een fysisch proces dat afhankelijk is van spectrale overlap en juiste dipool gerichtheid van de twee fluoroforen (zie figuur). Waar normaal een geëxiteerde fluorofoor terug valt naar de grondtoestand met uitzending van een foton, resulteert FRET in de excitatie van een nabijgelegen acceptor fluorofoor dat op zijn beurt een foton uitzend als het terugvalt naar de grondtoestand. Het plaatsvinden van FRET wordt gekarakteriseerd door een afname in de geobserveerde donor emissie, en een gelijktijdige toename van gesensiteerde (toegenomen) acceptor emissie (zie figuur). Ook al is het fenomeen al jaren geleden beschreven heeft FRET recent weer nieuwe interesse opgeroepen met het beschikbaar komen van genetisch gecodeerde GFP varianten (zie zijkant).- Afstand is alles
Belangrijk is dat FRET extreem gevoelig is voor de afstand tussen beide fluoroforen (zie figuur). Voor CFP en YFP is de karateristieke half-maximale afstand, de Förster radius, 49-52Å. Vanwege deze gevoeligheid, en het feit dat deze afstanden precies passen bij de grootte van de meeste biologische moleculen, is FRET een ideale manier om biologische processen te bestuderen (zie figuur). Bijvoorbeeld kan het gebruikt worden om eiwit-eiwit interacties te bestuderen als beide eiwitten zijn gelabeld met een fluorofoor. FRET zal in dat geval alleen worden geobserveerd als beide eiwitten zo dicht bij elkaar in de buurt zijn dat ze bijna wel moeten interacteren. Een tweede toepassing is om conformationele veranderingen te volgen door een enkel eiwit met twee verschillende fluoroforen te labelen. Veranderingen in conformatie van het eiwit vertalen zich dan in veranderingen in FRET tussen beide fluoroforen. Tenslotte zijn dergelijke concepten ook toegepast om succesvolle probes the maken voor het meten van de aanwezigheid en concentratie van kleine biomoleculen zoals bivalente ionen (bijv. calcium) en signaal moleculen (bijv cyclisch AMP), of for het meten van enzym activiteit zoals die van kinases.- Confocale FRET microscopie
FRET kan worden gedetecteerd door gesensitiseerde emissie te meten met behulp van een confocale microscoop. Op deze manier kunnen interacties tussen eiwitten worden gemeten in levende cellen op ongekende resolutie. Toch vereisen deze metingen nauwkeurige calibratie van de apparatuur en vele controles. Eën van de grote problemen vormt de spectrale overlap tussen CFP en YFP. Ook al is deze strikt noodzakelijk voor FRET om plaats te vinden, maakt het separatie van beide signalen zeer moeilijk, en doorlek signalen zijn daarom onvermijdelijk. Om te compenseren voor doorlek doen wij samen met de cellen van interesse een co-kweek van cellen die of CFP- of YFP-gelabeld histon 2b (H2B) tot expressie brengen zie figuur. Met behilp van software ontwikkeld binnen ons instituut door de groep van Kees Jalink worde de CFP en YFP afbeeldingen gecorrigeerd voor directe excitatie van YFP en CFP doorlek in het YFP-kanaal. De software corrigeert verder voor een nog een aantal problemen die specifiek zijn gerelateerd aan het gebruik van confocale FRET microscopie (zie de referentie hieronder voor gedetaileerde informatie). Vervolgens worden na correctie de afzonderlijk genomen CFP en YFP opnamen gebruikt om de gesensitiseerde emissie, oftewel de 'FRET' afbeelding, te berekenen. Dit signaal is nog steeds afhankelijk van het aantal moleculen op een gegeven positie, en verteld alleen of er FRET plaatsvindt of niet. Daarom wordt tot slot het FRET signaal gedeeld door de hoeveelheid donor of acceptor moleculen om de FRET efficientie te bepalen op elke positie. Een voorbeeld experiment wordt hier getoond.- Referentie
- J. van Rheenen, et al. Biophysical Journal 2004 vol. 86, pp.2517-2529 |
PubMed >>
FRET dankt zijn heropleving aan de grote oceaan kwal Aequorea victoria die bekend staat om het groene licht dat het uitstraalt. In het begin van de jaren 90 ontdekten wetenschappers dat dit licht wordt geproduceerd door twee eiwitten. Het eerste, aequorin produceert blauw licht dat vervolgens wordt omgezet in groen licht door een tweede eiwit dat daarom Green Fluorescent Protein, oftewel GFP werd genoemd. Sinds dat moment hebben wetenschappers een grote variatie aan kleuren varianten gemaakt. Twee daarvan, CFP (cyaan) en YFP (geel) zijn zeer geschikt voor FRET metingen, en leidden tot hernieuwde interesse voor deze techniek.
In 1948 publiceerde Th. Förster zijn werk Zwischen-molekulare energiewanderung und fluoreszenz, waarin hij beschrijft dat de efficientie van FRET tussen twee fluoroforen met de macht zes afneemt met hun onderlinge afstand. Dit heeft naam gegeven aan de term Förster radius, de afstand tussen twee fluoroforen waar de FRET efficientie half-maximaal is. Juist omdat FRET zo gevoelig is voor afstand, functioneert het als een soort moleculaire lineaal, ook al zijn absolute metingen vaak niet mogelijk vanwege de onzekerheid in fluorofoor orientatie en positie.
De lifetime van een fluorofoor is de gemiddelde tijd dat het in de aangeslagen toestand verblijft voordat het weer terug valt naar het grond niveau, normaal gesproken in de orde van nanoseconden. Eën van de eigenschappen van FRET is een afname in lifetime van de donor fluorofoor vanwege de geïnduceerde overdracht van energie naar de acceptor fluorofoor. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, oftewel FLIM, maakt gebruik van dit fenomeen om FRET te detecteren door de lifetime te meten in plaats van de intensiteit van de fluoroforen. Een groot voordeel van deze techniek is dat het als veel kwantitatiever wordt beschouwd dan de klassieke FRET benaderingen.